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最大劑量法

1、試驗(yàn)前準(zhǔn)備：試驗(yàn)前1天，對每只動物進(jìn)行編號并稱量體重，用電動剃刀徹底剪除試驗(yàn)部位被毛。觀察每只動物健康狀況。

5.1皮內(nèi)誘導(dǎo)：按下圖所示，在每只動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位成對皮內(nèi)注射0.1mL。

1—頭部
2—0.1ml皮內(nèi)注射點(diǎn)
3—去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位
4—尾部

部位A：注射弗氏完全佐劑與選定的溶劑以50:50（體積比）比例混合的穩(wěn)定性乳化劑。

部位B：注射試驗(yàn)樣品（未經(jīng)稀釋的浸提液）；對照組動物僅注射相應(yīng)浸提介質(zhì)。

部位C：試驗(yàn)樣品（部位B中采用的濃度）以50:50的體積比例與弗氏完全佐劑和浸提介質(zhì)（50%）配制成的乳化劑混合后進(jìn)行皮內(nèi)注射；對照組注射空白液與佐劑配制成的乳化劑。

2、局部誘導(dǎo)：皮內(nèi)誘導(dǎo)后7d，未產(chǎn)生刺激反應(yīng)，局部敷貼應(yīng)用前24h，試驗(yàn)區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉進(jìn)行預(yù)處理，按摩導(dǎo)入皮膚后，用面積8cm2的無菌紗布浸透浸提液，局部貼敷于每只豚鼠的肩胛骨內(nèi)側(cè)，覆蓋誘導(dǎo)注射點(diǎn)。用封閉式包扎帶固定，48h后除去包扎帶和紗布塊。同法用空白浸提介質(zhì)操作對照組動物。

3、激發(fā)：局部誘導(dǎo)后14d，用無菌紗布塊分別置于試驗(yàn)樣品浸提液和對照液中浸透，分別貼敷于每只動物的上腹部去毛區(qū)（誘導(dǎo)階段未試驗(yàn)部位）。用封閉式包扎帶固定，并于24小時±2小時后除去包扎帶和敷貼片。

觀察時間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級。

封閉貼敷試驗(yàn)（Buehler試驗(yàn)）

1、試驗(yàn)前準(zhǔn)備：試驗(yàn)前1天，對每只動物進(jìn)行編號并稱量體重，用電動剃刀徹底剪除試驗(yàn)部位被毛。觀察每只動物健康狀況。

2、誘導(dǎo)階段：試驗(yàn)組將樣品剪成適當(dāng)尺寸的敷貼片，局部貼敷于每只動物的左上背部位。（6±0.5）h后除去任何封閉式包扎帶類的固定物和敷貼片。1周中連續(xù)3d重復(fù)該步驟，同法操作3周。對照動物將合適尺寸的無菌紗布浸透對照液同法操作。

3、激發(fā)：最后一次誘導(dǎo)貼敷后（14±1）d，用試驗(yàn)樣品對試驗(yàn)動物進(jìn)行激發(fā)。用貼敷片單獨(dú)局部貼敷于每只動物去毛的未試部位。（6±0.5）h后去除封閉包扎帶和敷貼片。對照組動物同法操作。

觀察：除去敷貼片后24h和48h觀察試驗(yàn)組和對照組動物激發(fā)部位皮膚反應(yīng)情況，按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級。

4、觀察：除去敷貼片后24h和48h觀察試驗(yàn)組和對照組動物激發(fā)部位皮膚反應(yīng)情況，按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級。